1.伊事达的铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)，英文名称为Ferroptosis Fluorometric Assay Kit with RhoNox6 and CM-H2DCFDA，是一种基于亚铁离子(Fe2+)红色荧光探针RhoNox-6和活性氧绿色荧光探针CM-H2DCFDA双荧光探针组合，快速灵敏地同步检测活细胞内亚铁离子与活性氧，从而判定是否发生铁死亡的试剂盒。本试剂盒可以使用荧光显微镜进行荧光成像检测，也可以使用荧光酶标仪和流式细胞仪等进行荧光的定量检测。本试剂盒可实现对铁死亡关键标志物的实时动态监测，适用于多种铁死亡相关研究，包括铁代谢、氧化应激以及与铁死亡密切相关的疾病研究如癌症、神经退行性疾病、肾损伤、心血管损伤等，同时也可用于筛选或验证铁死亡的诱导剂或抑制剂。
2.铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性、与细胞凋亡不同的细胞死亡形式。铁浓度过高时，亚铁离子可通过Fenton反应催化产生羟基自由基(·OH)，进而引发脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤。同时细胞膜或细胞器膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子(PUFA-PLs)被过氧化而破坏膜结构，导致膜通透性增加甚至膜破裂，最终诱发调节性细胞死亡(Regulated cell death, RCD)，也称程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD) 。铁死亡与癌细胞增殖调控、神经毒性损伤、神经退行性疾病进展、急性肾衰竭病理过程、药物性肝毒性反应，以及肝脏和心脏缺血/再灌注损伤修复、T细胞免疫功能调节等多种生理病理过程密切相关。因此，检测细胞铁死亡对揭示细胞生理功能调控机制、解析疾病发生发展规律具有重要意义。 本试剂盒可对活细胞内亚铁离子与活性氧两个铁死亡关键标志物进行实时动态监测，从而评估铁死亡的发生与进展。细胞内亚铁离子积累和活性氧升高在铁死亡中均起关键作用，是铁死亡标志物中比较关键的两种。
3.本试剂盒中的RhoNox-6是一种新型亚铁离子(Ferrous)红色荧光探针，具有高选择性、高灵敏度、高稳定性、低细胞毒性和优异的细胞膜通透性等特点，与亚铁离子结合后，其荧光信号显著增强，从而实现对活细胞内游离亚铁离子的精准检测；CM-H2DCFDA是一种绿色的活性氧(Reactiveoxygen species, ROS)探针，本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成CMH2DCF，而CM-H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，后续细胞内的活性氧可以氧化无荧光的CMH2DCF生成有绿色荧光的CM-DCF ，检测CM-DCF的荧光就可以量化细胞内活性氧的水平。

1. RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的配制。
对于6、12、24、96孔板，每孔所需的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液(RhoNox-6/CM-H2DCFDA Staining Solution)的用量分别为1ml、500μl、250μl和100μl。对于悬浮细胞样品或流式细胞仪检测，每50-100万个细胞样品需0.5ml RhoNox-6/CMH2DCFDA染色液。根据样品数量，计算所需RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的体积。以96孔板每孔100μl RhoNox-6/CMH2DCFDA染色液的体系为例，参考下表配制RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。

注1：配制好的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液必须一次使用完毕，不能冻存。RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液中RhoNox6、CM-H2DCFDA的浓度可以根据染色效果在0.2-2X之间适当调整。
注2：*血清和酚红对RhoNox-6荧光探针的检测有干扰，须避免。如果酚红不可避免，可染色后换成Assay Buffer。也可以直接使用Assay Buffer进行RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的配制，但染色效果可能没有无血清无酚红的细胞培养液好。
注3：本试剂盒不提供Hoechst 33342，可根据实际需求进行选做Hoechst 33342的染色。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。

2. 阳性对照的诱导方法。
根据实验设计，诱导细胞内亚铁离子浓度变化可以选择使用高铁血红素(≥97.0%) 、转铁蛋白(Transferrin)、铁死亡诱导剂如Erastin (Ferroptosis诱导剂或硫酸亚铁铵六水(99.99%）等。Hemin可释放铁离子诱导铁死亡，作为铁死亡诱导模型构建的阳性对照。亚铁离子螯合剂2,2'-联吡啶(99%)通过螯合胞内游离亚铁离子以阻断Fenton反应，而Ferrostatin-1 (Fer-1) (98%)作为脂溶性抗氧化剂可抑制脂质过氧化物积累，后两者分别从铁离子调控和脂质氧化抑制双通路实现对铁死亡进行特异性阻断，可作为铁离子依赖型抑制剂对照，具体处理方法如下。如果本试剂盒用于筛选或验证铁死亡的诱导剂或抑制剂，可参照进行。
A. 试剂准备。
a) 50µM Hemin的配制：用DMSO配制适量的100mM的Hemin储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀，使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为50µM。
b) 10mM BPY的配制：用DMSO配制1M的BPY储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀。使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为10mM。
c) 2μM Ferrostatin-1的配制：用DMSO配制10mM的Ferrostatin-1储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀。使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为2μM。

注1：BPY需密封保存，避免潮解。
注2：Hemin、BPY、Ferrostatin-1对细胞的影响因细胞类型而异，因此建议根据特定的细胞适当调整使用浓度。实验前需进行预实验，确定比较适合的浓度。
B. 细胞处理。
使用Hemin或Hemin+BPY+Ferrostatin-1处理待检测的细胞，置于细胞培养箱中孵育15-30分钟。仅使用Hemin处理的为阳性对照(Positive control)。根据实验需求，孵育时间可进行适当调整。孵育结束后，用HBSS轻柔洗涤细胞3次，随后可使用RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液进行染色。注：细胞使用Hemin或Hemin+BPY+Ferrostatin-1处理可能对细胞活力有影响，定量检测时建议使用萨默斯的CCK-8试剂盒、发光法细胞活力检测试剂盒或EdU细胞增殖检测试剂盒等产品进行检测，并和本试剂盒检测结果进行校正处理(Normalization)。

3. 荧光显微镜检测。
a. 接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理(如诱导铁死亡)。
b. 洗涤。对于贴壁细胞，吸除培养液，酌情用HBSS轻柔洗涤细胞1-3次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用HBSS轻柔洗涤1-3次。
注：对于贴壁细胞，如果需要同时检测其中的非贴壁细胞，例如诱导铁死亡后不再贴壁的细胞，每次洗涤吸除液体前须适当离心，以确保不再贴壁的细胞不会被吸走。
c. 染色。加入适当体积的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色变弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d. 检测。孵育结束后，如果使用不含血清和酚红的细胞培养液配制染色液，可以直接在荧光显微镜下观察染色效果。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm。如果使用无血清但含酚红的细胞培养液配制染色液，建议根据细胞类型去除染色液，如对于贴壁细胞，需吸除染色液；对于悬浮细胞，需在室温下以250-1000×g离心5分钟，吸除上清。再加入本试剂盒提供的Assay Buffer进行检测。

4. 流式细胞仪检测。
a. 细胞准备。贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，400×g室温离心5分钟，弃上清；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清。每个样品推荐的细胞用量为50-100万个细胞。
b. 洗涤。用HBSS轻轻重悬细胞，400×g室温离心5分钟，弃上清。如有必要，可以再重复洗涤1-2次。
c. 染色。对于上一步骤的50-100万个细胞的沉淀，加入0.5ml RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色变弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d. 检测。孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以250-1000×g室温离心5分钟沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5ml Assay Buffer重悬细胞后用流式细胞仪检测。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，推荐用PE通 道(Ex/Em=561/585)进行检测，CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm，推荐用FITC通道(Ex/Em=488/525nm)进行检测。
注1：使用仅含检测缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式检测的阴性对照设置。
注2：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液稀释倍数进行适当调整。

5. 荧光酶标仪检测。
a. 接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) ，每孔的细胞数需要控制在1000-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理(如诱导铁死亡)。
注：细胞接种数量需要考虑到检测时的细胞数量。如果接种后需要培养一段时间或药物处理时间比较长，则需要适当控制接种细胞数量，使检测时细胞密度为70-90%为佳。
b. 洗涤。对于贴壁细胞，吸除培养液，酌情用HBSS轻柔洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用HBSS轻柔洗涤1次。
注：对于贴壁细胞，如果需要同时检测其中的非贴壁细胞，例如诱导铁死亡后不再贴壁的细胞，每次洗涤吸除液体前须适当离心，以确保不再贴壁的细胞不会被吸走。由于96孔板中每孔细胞数量较少，建议仅进行一次洗涤，以减少细胞损失。
c. 染色。加入适当体积的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色减弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d. 检测。孵育结束后，可以直接用荧光酶标仪检测。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，波长宽度推荐5nm或10nm。CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm，波长宽度推荐5nm。贴壁细胞推荐底读，悬浮细胞顶读或底读均可。

-20ºC保存，一年有效。RhoNox-6 (1000X)和CM-H2DCFDA (1000X)须避光保存。

1.第一次使用时建议把RhoNox-6 (1000X)、CM-H2DCFDA (1000X)适当分装后保存，以避免反复冻融。

2.血清和酚红(Phenol red)对本试剂盒中RhoNox-6荧光探针的检测有干扰，须尽量避免。其中血清的干扰比较严重，强烈建议避免使用；酚红的存在会导致荧光背景增强，检测效果略有下降。

3.本试剂盒仅限于存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。对于需要胰酶消化处理的细胞，建议先进行胰酶消化，然后再进行染色。

4.RhoNox-6须避免与金属离子接触。RhoNox-6、CM-H2DCFDA在4ºC、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25ºC水浴温育尽量短的时间至全部融解，并适当离心至管底后使用。

5.RhoNox-6、CM-H2DCFDA的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等可根据所使用的细胞类型及给予的特定处理预先进行适当摸索和优化，CM-H2DCFDA和RhoNox-6最优先的推荐终浓度为1X，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，RhoNox-6和CM-H2DCFDA的浓度可在0.2-2X之间适当调整。

对于某些细胞，如果发现未处理的阴性对照细胞组CM-H2DCFDA荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释CM-H2DCFDA再进行染色。

6.荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板。

7.荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

8.我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。

9.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。 

10.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。 

11.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。 

备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。