此试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶消化植物细胞壁，再经过滤洗涤去除杂质获得原生质体，通过聚乙二醇(PEG)法进行原生质体融合。适用于从30 d的拟南芥幼苗中分离原生质体。获得的原生质体可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，转录因子的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次10 mL酶解液的使用量，可供10次原生质体制备以及240 个转化反应。

一、准备工作

1. 需要自行准备的材料：

锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，切过尖的灭菌蓝枪头和黄枪头、10 μL 白枪头(进口的更佳)。

2.酶解液配制：

注：

1. 酶解液必须现配现用。

2. 根据实验的需要选择酶解液是否需要过滤除菌。

3. 将培养液CM放在冰上预冷，便于后续使用。

二、原生质体的分离制备

1. 准备30d的拟南芥幼苗，优选第 2、3 和 4 对叶片(黄化的原生质体更稳定)。建议使用无菌播种得到的拟南芥幼苗，效果更佳。

注：若使用土培苗，最好用无菌 ddH₂O 冲洗擦干后使用，减少细菌的繁殖。

2. 取10-20个拟南芥叶片(样品量约1g，可适当增加)，用锋利刀片平行主叶脉，切成 0.5-1.0 mm的细丝。

3. 将切好的细丝放入装有10 mL酶解液的50 mL 容积的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞。

注：避光步骤可防止原生质体重新生长出细胞壁，植物细胞壁不利于后续转化。

4. 避光 28 ℃，45 rpm 摇床上孵育3-4 h。收集原生质体前，80 rpm 摇动5 min，让原生质体完全释放出来。

5. 用 1 mL 培养液CM润洗细胞筛后，弃废液。

6. 将酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻挤压酶解物帮助充分释放原生质体，此时肉眼可见浓绿色液体滴落（挤压步骤十分重要）。用5 mL 的培养液CM冲洗酶解器皿和未消化的叶片2次(用切过尖的蓝枪头冲洗)，将所有的液体收集到一个50mL离心管中。

可选：也可以在第一次过滤后，小心将植物组织转移到锥形瓶中，加入10mL的培养液CM，在28 ℃摇床80 rpm 摇动5min，第二次过滤后，再用5 mL培养液CM冲洗酶解器皿和未消化的叶片2 次。二次重悬过滤可以一定程度提高原生质体的产率，增加转化数。

注：1. 操作过程尽可能轻柔，避免剧烈震荡，过滤时可以将50 mL 离心管倾斜70°，可以缓冲溶液下落时产生的碰撞力，防止原生质体破碎。2. 黄化苗酶解后的原生质体不呈绿色，过滤完成后，可以取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，可继续进行实验；如果细胞扁且发黑，则弃去。

7. 选用水平转子，室温100 g离心3 min，升速3，降速3，去除上清(管中绿色沉淀即为原生质体)。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上导致破碎；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。且过快的升降速会使原生质体破碎。建议升速和降速分别都使用 3。

8. 加入10 mL培养液CM温柔重悬位于底部的原生质体(切过尖的蓝枪头)，100 g 离心 3 min， 升速 3，降速 3，去上清。

9. 加入1 mL培养液CM，重悬原生质体，冰上避光静置30 min。

10. 在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

血球计数板的使用：

       如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1 mm的方形区域进行计数(25 个中方格)。分别统计正方形四个顶角和中央 的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以 25(正方形被分成了 25 个小正方形)，计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL(长 1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm)。计算获得的细胞数量。原生质体浓度(个/mL)=25 个中方格原生质体数×10⁴×稀释倍数。
                                    

11. 100 g离心3 min，升速3，降速3，去上清，用相应体积的重悬液RS重悬原生质体，调整原生质体密度为2×10⁵ /mL。(根据细胞数量和所需反应数，加入对应的重悬液RS 体积，100 μL/1 个反应)

三、原生质体的转化

1. 在2 mL的灭菌圆底离心管中加入3-20 µg(总体积不超过10 µL，根据实验需要用无菌ddH₂O 补齐)纯化后的高质量质粒(建议去内毒素)，随后加入100 µL 调整好浓度的原生质体，轻弹充分混匀。

2. 加入110 µL 的转化液TP，轻弹混匀或切过尖的蓝枪头轻轻吸打混匀，过程中应避免产生气泡，室温孵育3-30 min(常规实验不超过15 min)。

注：去内毒素质粒对转化效率有极明显提升(近3 倍)，建议购买去内毒素质粒大提试剂盒(吸附柱法)。转化液TP较难溶解，需65 ℃水浴完全溶解后(约 10 min)，冷却至室温后使用。原生质体与转化液TP较难混匀，请耐心缓慢的吸打，以至充分混匀，保证转化效率。

3. 加入500 μL 培养液CM，轻柔颠倒混匀，终止转化。室温100 g 离心2 min，升速降速3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去上清。

4. 加入500 μL 培养液CM重悬原生质体，室温100 g离心2 min，升速3，降速3，去上清。

四、原生质体的培养和收集

1. 加入500 μL 培养液CM培养悬浮细胞。将离心管水平室温避光放置，孵育 12-16h。

2. 收集细胞时，缓慢拿起离心管，用枪头将附着在管壁上的细胞轻轻悬起，离心管室温垂直静置3 min后再离心，室温100 g离心2 min，升速3，降速 3，去除大部分培养液 CM，收集原生质体，用于后续实验。

1.A盒：-20℃，储存。
2.B盒：常温，储存。

1. 分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能轻柔。

2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转子。

3. 实验过程中尽可能使用切过尖的1 mL蓝枪头，保证平滑。因为其尖端的孔径较大，会避免原生质体破裂。

4. 若无水平转子，可适当调整离心力、离心时间、升降速，以保证实验成功。

5. 转化时建议添加空载荧光对照，以验证操作步骤无问题。

6. 土培的成株期植株的组织分离效果会偏差，属于正常现象

7.我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。

8.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。 

9.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。 

10.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。 

备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。