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基本信息-
产品名称BCA蛋白定量试剂盒
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保存温度室温
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有效期1年
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应用总蛋白定量的二喹啉甲酸/BCA分析
产品简介目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是：BCA 法和 Bradford 法。
BCA 法测蛋白的原理是在碱性环境下蛋白质与 Cu2+络合并将 Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在 562 nm 处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。BCA 法与传统方法相比,操作更简单、试剂及其形成的颜色复合物更稳定、灵敏度更高。BCA 法测定蛋白浓度兼容性亦很好,不受大部分样本中其他成分的影响,对于 5%以内的去垢剂如 SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween80、NP-40 具有很好的兼容性,但易受螯合剂、还原剂等的影响,在测定蛋白浓度前应尽量使样本满足如下要求：EDTA 浓度≤10mM、DTT 浓度≤1mM、2-ME≤0.01%、无 EGTA。
本品BCA Protein Assay Kit 在 50～2000μg/ml 浓度范围内有较好的线性关系。本试剂盒适用于微量蛋白质浓度的测定,其最小检出量为 25μg/ml。
产品组成| 组分 | 250T | 500T | 2500T | 保存温度 |
| 试剂(A): BCA 试剂 A | 50ml | 100ml | 500ml | 室温 |
| 试剂(B): BCA 试剂 B | 1.5ml | 3ml | 15ml | 室温 |
| 试剂(C): 蛋白标准(BSA) | 20mg | 20mg | 20mg | 室温 |
| 试剂(D): 蛋白标准配制液 | 5ml | 10ml | 10ml | 室温 |
操作步骤（仅供参考）自备材料
1. 蒸馏水、生理盐水或 PBS
2. 酶标仪或分光光度计、EP 管、96 孔板或比色皿、恒温箱或水浴锅
操作步骤(仅供参考)
1. 取 1ml 蛋白标准配制液加入到含有 20mg 的蛋白标准(BSA)中,充分溶解后配制成20mg/ml 的蛋白标准溶液,配制后可立即使用,配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。
2. 取适量的 20mg/ml 蛋白标准溶液,稀释至终浓度为 500μg/ml,如取25μl 蛋白标准(20mg/ml),加入 975μl 稀释液,充分混匀即配制成 500μg/ml 蛋白标准溶液。
注意：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中,一般可用0.9%NaCl 或 PBS 作为 BSA 的稀释液,稀释后的 500μg/ml 蛋白标准溶液也应-20℃长期保存。
3. 根据样品数量,按试剂(A):试剂(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液,即取50 份BCA试剂A和 1 份 BCA 试剂 B,充分混匀,即获得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液应为苹果绿或墨绿色,如变为紫色或其他颜色应弃用)；例如取 5ml BCA 试剂 A 和0.1ml BCA试剂B, 配制成 5.1ml BCA 工作液,BCA 工作液室温 24 小时内稳定。
4. 将 500μg/ml 蛋白标准溶液按 0、1、2、4、8、12、16、20μl 加到96 孔板或EP管中, 加稀释液补足至 20μl,其蛋白标准浓度依次为 0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
5. 加 20μl 待测蛋白到 96 孔板或 EP 管中,如果样本不足 20μl,用稀释液补足至20μl。
注意：如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液不同,应在待测蛋白中加入20μl 稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液相同,无需在待测蛋白孔中加入20μl稀释液,以减少不同溶液的差异。
6. 向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液,迅速混匀,37℃孵育30～60min。
7. 冷却至室温,立即用酶标仪或分光光度计测定 562nm 波长处吸光度(如无562nm,540～595nm 之间的波长也可),各孔或 EP 管吸光度减去蛋白浓度为 0μg/ml 的标准管的吸光度,以求得的差值为纵坐标：以标准孔或 EP 管中蛋白浓度(μg/ml)为横坐标,得出标准曲线及回归方程,根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。
注意事项1. 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后,即获得蛋白标准原液(即20mg/ml的蛋白标准),该原液中含有防腐剂,不影响后续检测,该蛋白标准原液-20℃长期保存。
2. 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中,否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致,有可能导致测定不准确。
3. 如果检测效果不佳,可以室温放置 2h 或 60℃放置 30min,颜色会随着时间的延长不断加深,显色反应也会随温度升高而加快；如果浓度较低,可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
4. 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加,吸光度或颜色没有明显变化,可能的原因是样品中含有严重干扰 BCA 法测定蛋白浓度的物质。
5. 如检测样本中含有较多螯合剂、还原剂等影响因素时可考虑 Bradford 法测定。
6. 因 BCA 法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,建议每次测定时都作标准曲线,且显色反应的速度和温度有关,所以除非精确控制显色反应的时间和温度,否则每次都做标准曲线。
7. 如果没有酶标仪也可以用普通的分光光度计测定,但应考虑比色皿的最小测定体积,按比例适当加大 BCA 工作液的用量使总体积不小于最小检测体积,样品和标准品的用量亦相应按比例放大；使用分光光度计测定蛋白浓度时,可以测定的样品数量会显著减少。
8. 为了加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当加热,但切勿过热,否则易失效。
9. 试剂开封后请尽快使用,以防影响后续实验效果。
10. 为了加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热,但是切勿过热。室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。
11. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
12. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
13. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
14. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。
附表标准曲线制作：在室温条件下按说明书操作,对系列标准用酶标仪测定570nm 时的吸光度,其数值及标准曲线如下(仅供参考)：
| 蛋白标准(μg/ml) | 0 | 25 | 50 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 |
| 吸光度 | 0.205 | 0.211 | 0.266 | 0.364 | 0.547 | 0.72 | 0.87 | 1.009 |
注意：对于 10～50μg/ml 范围内的蛋白样品,要充分考虑如 EDTA、2-ME、DTT 等干扰因素,其检测结果波动较大,标准品亦有波动,请注意小心精细操作,建议采购微量BCA 蛋白定量试剂盒F14197。
