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斑马鱼产品
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产品简介1.过氧化氢和过氧化物酶活性荧光法检测试剂盒（H2O2 and POD Fluorometric Assay Kit）使用荧光红探针，一步法并且超灵敏测定生物样本中释放的过氧化氢和过氧化物酶活性。
2.本试验盒的检测原理：在辣根过氧化酶(HRP)作用下，荧光红探针与H2O2以1:1的比例反应产生红色荧光氧化产物，通过检测光度变化可得出的H2O2含量, 氧化产物的最大吸收560nm，荧光激发和发射波长分别约为571 nm和585 nm，可用分光光度法或荧光法检测。而在H2O2过量的情况下，荧光红还可超灵敏地测定过氧化物酶的活性。
3.本方法检测仅为一步法，并且超灵敏，100µL检测体积可检测出低至10pmol H2O2 (即50nmol/L)和1 × 10–5 U/mL 的POD酶活性。
产品组成| 试剂编号 | 试剂组成 | 规格装量 | 保存条件 |
| R1 | 组份A：5×反应Buffer | 30mL | 2-8°C保存 |
| R2 | 组份B：H2O2 | 200 µL | |
| R3 | 组份C：HRP | 10 U | |
| R4 | 组份D：荧光红 | 1管 | -20°C 避光保存 |
| R5 | 组份E ：DMSO | 700µL | 2-8°C保存 |
检测方法A 测定H2O2含量的方法
1.配制1X反应Buffer:：取4mL 组份A（5×反应Buffer）加16mL dH2O稀释而成20mL的1×反应Buffer。
2.配制H2O2 标准曲线或阳性、阴性对照
2.1首先取22.7 µL组份B（H2O2原液）加入 977 µL的1×反应Buffer， 配成20mM的H2O2；，
2.2 再取5µL的20mM 的H2O2，加入995µL的1×反应Buffer，稀释成100µM的H2O2工作液
2.3微孔板按50μL/孔，在0-10μM浓度范围配制H2O2标准液，参考下表：
| H2O2标准浓度 μM | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
100µM的H2O2工作液加入体积 μL | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1×反应Buffer加入体积 μL | 50 | 49 | 48 | 47 | 46 | 45 |
2.4 如果不使用标准曲线，则需准备如下的阳性和阴性对照,
阳性对照 用1X 反应Buffer稀释H2O2工作液至10 µM，每孔加入50μL、10 µM的 H2O2。
阴性对照 用不含H2O2的1×反应 Buffer, 每孔加入50μL
3.样本孔加入50 µL用1X 反应 Buffer适当稀释的待测样本（稀释倍数可经预试验而确定）
4.配制荧光红/HRP工作液
4.1 组份D（荧光红）每管加入60μL的 DMSO溶解（预先恢复至室温），配成荧光红液（10mM 每管可供100T检测，即用即配，不可贮存），
4.2 组份C（HRP）加入1mL的 1X反应Buffer， 配成10U/mL HRP储液 (可分装小份，-20保存）：
4.3 取50μL的荧光红液、100μL的HRP储液，加入4.85mL的1×反应Buffer， 混匀即为5mL的荧光红/HRP工作液（5mL可供100T分析）。
5.每孔加入50 µL的荧光红/HRP工作液：
6.室温，避光孵育 30min；
7.酶标仪测定吸收值A560nm 或 荧光光度 Ex/Em=540/590nm；
8.建立标准曲线与酶活计算
建标准曲线：以H2O2的标准浓度（表1中的浓度减半，即0、1、2、3、4、5µM)为横坐标，以空白/阴性对照组减去标准液孔的吸光值或荧光值为纵坐标，建立标准曲线。
计算样本H2O2浓度： 用空白/阴性对照组减去样本组的吸光值或荧光值，利用标准曲线算出对应的H2O2浓度。
如果测定细胞释放出胞外的H2O2浓度，则可在空孔预加入50μL的荧光红/HRP工作液和50μL的1×反应Buffer，37℃ 预热10min后 再加入 20 μL约1.5 ×104细胞的PBS悬液，混匀后，直接上酶标仪，测定不同时间点的吸收值A560nm 或 荧光光度 Ex/Em=540/590nm，同时设不加细胞的只加PBS的空白对照。
B 测定过氧化物酶POD活性的方法
B1. 配制过氧化物酶POD标准曲线或阳性、阴性对照
B1.1 将 10U/mL HRP储液 （A4.1步配制）用1X反应Buffer:(A1步配制) 稀释1000倍至10mU/mL,进一步在0-2 mU/mL浓度范围内进行梯度稀释，配制成HRP标准液，按50μL/孔加入微孔板，可参考下表：
| HRP标准浓度mU/mL | 0 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 |
| 10mU/mL HRP液加入体积 μL | 0 | 0.625 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 |
| 1×反应Buffer加入体积 μL | 50 | 49.375 | 48.75 | 47.5 | 45 | 40 |
B1.2 如果不使用标准曲线，则需准备如下的阳性和阴性对照,
阳性对照孔： 用1×反应Buffer稀释10U/mL HRP储液至2 mU/mL，每孔加入50μL。
阴性对照孔： 不含 HRP的1×反应 Buffer, 每孔加入50μL。
B2 样本孔加入50 µL用1×反应 Buffer适当稀释的待测样本（稀释倍数可经预试验而确定）
B3 配制荧光红/H2O2工作液
B4 在样本孔、标准液孔，对照孔 空白孔等加入50 µL 的荧光红/H2O2工作液, 混匀，开始反应，
B5 微孔板置室温，避光孵育30 min；（也可自行确定不同时间进行反应动力学检测）
B6 酶标仪测定A560 nm吸光度，或荧光光度Ex/Em=530-560nm/590nm。
B7 建立标准曲线与酶活计算
建标准曲线：以HRP的标准浓度（表2中的浓度减半，即0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mU/mL)为横坐标，以空白/阴性对照组减去标准液孔的吸光值或荧光值为纵坐标，建立标准曲线。
计算样本POD酶活性： 用空白/阴性对照组减去样本组的吸光值或荧光值，利用标准曲线算出对应的酶活性。
注意事项1.我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
2.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
3.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
4.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。
