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斑马鱼产品
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产品简介乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)是单链RNA，幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，蚊子是乙脑病毒的传播媒介。当人受带病毒的蚊子叮咬后，乙脑病毒进入人体，在血管内皮细胞、淋巴结、肝、脾等吞噬细胞内增殖，并经血液循环到达脑部而引起炎症。因此快速检测乙型脑炎病毒具有重要的意义。
产品组成| 组分 | 规格 |
| 2×SYBR qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2 | 50μL |
| 荧光PCR模板专用稀释液 | 1mL |
| 乙型脑炎病毒RT-PCR引物干粉 | 50T |
| 乙型脑炎病毒RT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) | 50μL |
产品特点1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
2.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
3.根据乙型脑炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本试剂盒既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
6.本试剂盒足够50次20μL体系的RT-PCR反应。
使用方法(仅供参考)溶液配制
引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释阳性对照
以101～106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。
1.标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
2.换枪头，在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×104拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
6.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
7.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。
下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
| 成分 | 样品管N+2个 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性对照(1~6管) |
| 2×qRT-PCR缓冲液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 乙型脑炎病毒RT-PCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
| N+2个RNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 |
| 自备超纯水 | 不加 | 7μL | 不加 |
| 6个阳性对照稀释液 | 不加 | 不加 | 各7μL |
| 10×qRT-PCR酶混合液v2 | 1μL | 1μL | 1μL |
10.上机后按下面参数进行RT-PCR。
| 过程 | 温度 | 时间 |
| RT(逆转录) | 50℃ | 10min |
| 预变性 | 95℃ | 10min |
| PCR反应 (35个循环) | 95℃ | 15sec |
| 60℃ | 60sec(采集SYBR通道的荧光信号) | |
| 按仪器预设程序进行溶解曲线分析 | ||
注：循环次数最好不要超过35次。
四、数据处理
11.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
12.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
13.如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
14.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
15.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。
储存与保存1.保存：-20℃
2.有效期：2年
注意事项1.我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
2.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
3.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
4.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。
