■ JC-10 是一种检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)的理想荧光探针，能够快速灵敏地反映细胞、组织或者纯化的线粒体膜电位的变化。
■ 在线粒体膜电位较高时，JC-10 聚集在线粒体的基质(matrix)中形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-10 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-10 为单体，产生绿色荧光。这样就可以通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过 JC-10 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，这种转变也可作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-10 单体的最大激发波长为490nm，最大发射波长为 525nm。JC-10 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为540nm，最大发射波长为 590nm，荧光分光光度计检测红/绿色荧光强度的比率用于测定线粒体膜电位（MMP）。实际观察时使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的装置即可。
■ 本品线粒体膜电位检测试剂盒(JC-10 法)(Mitochondrial membrane potentialassay kit with JC-10)是一种以 JC-10 为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

1. 配制 JC-10 染色工作液：
取适量 JC-10 Stain (200×)，按照每 50μl JC-10 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释 JC-10，剧烈 Vortex 充分溶解并混匀 JC-10 Stain。然后再加入2ml JC-10 Buffer(5×)，混匀后即为 JC-10 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-10 染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的 JC-10 染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每0.5～1.0×10⁶ 细胞需 0.5ml JC-10 染色工作液。
2. 设置阳性对照：
推荐 CCCP(1mM)按照 1:100 的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20min。随后按照下述方法装载 JC-10，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常 10μM CCCP 处理 20min 后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-10 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经 JC-10 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
3. 对于悬浮细胞：
a. 取 1×10⁵～6×10⁵ 细胞，重悬于 0.5ml 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b. 加入 0.5ml JC-10 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。
c. 在孵育期间，按照每 1ml JC-10 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的JC-10 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后， 4℃ 600g 离心 3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
e. 用 JC-10 Buffer(1×)洗涤 2 次：加入 1ml JC-10 Buffer(1×)重悬细胞，4℃600g离心 3～4min，沉淀细胞，弃上清。再加入 1ml JC-10 Buffer(1×)重悬细胞，4℃600g离心 3～4min，沉淀细胞，弃上清。
f. 再用少量 JC-10 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4. 对于贴壁细胞：
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a. 吸除 6 孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入 1ml 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
b. 加入 1ml JC-10 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育20min。
c. 在孵育期间，按照每 1ml JC-10 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的JC-10 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后，吸除上清，用 JC-10 Buffer(1×)洗涤 2 次。
e. 加入 2ml 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5. 对于纯化的线粒体：
a. 把配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 Buffer(1×)稀释 5 倍。
b. 0.9ml JC-10 染色工作液中加入 0.1ml 总蛋白量为 10～100μg 纯化的线粒体。
c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为 485nm，发射波长为 590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm 时，可以在 475～520nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤 6。
6. 荧光观测和结果分析：
检测 JC-10 单体时可以把激发光设置为 490nm，发射光设置为530nm；检测JC-10聚合物时，可以把激发光设置为 525nm，发射光设置为 590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测 JC-10 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP 或FITC时的设置；检测 JC-10 聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3 时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

1. JC-10 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用，但应避免反复冻融。必须先把JC-10用ddH2O 充分溶解混匀后，才可加入 JC-10 Buffer(1×)。不可先配制JC-10 Buffer(1×)再加入 JC-10 Stain(200×)，否则导致 JC-10 很难充分溶解，严重影响后续的检测。
2. 对于 6 孔板中的样品，本试剂盒共可以检测 100 个样品；对于 12 孔中的样品，本试剂盒共可以检测 200 个样品。
3. 装载完 JC-10 后用 JC-10 Buffer(1×)洗涤时，尽量使 JC-10 Buffer(1×)保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。
4. JC-10 探针装载完并洗涤后尽量在 30min 内完成后续检测，在检测前需冰浴保存。
5.  勿把 JC-10 Buffer(5×)全部配制成 1×，因为操作过程中需直接使用JC-10 Buffer(5×)。
6. 如 JC-10 Buffer(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。
7. CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有一定毒性，请注意小心防护。

8. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
9. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

10. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

11. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。