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斑马鱼产品
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基本信息-
产品名称Calcein-AM/EthD-I 活细胞/死细胞双染试剂盒
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保存温度按试剂盒各组分温度保存
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有效期1年
产品简介Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm,Em=515nm）。因其在传统的 Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。
由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。但是碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，而EthidiumHomodimer-I(EthD-I)是一种高亲和性的荧光核酸染料，带有较强正电荷，所以该染料不能穿过细胞膜进行活细胞染色，但是能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核并且嵌入DNA 双链从而产生红色荧光。可以使荧光增强 30 多倍。因此 EthD-I 是一种较灵敏的核酸染色剂用于哺乳动物、细菌、酵母和真菌的染色，Ex/Em (结合 DNA）= 528/617 nm 。
本试剂盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 EthD-I 的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就200µL细胞悬液进行染色，可以做 500 次检测。
产品组成| 组分 | 规格 | 保存温度 |
| Calcein-AM Solution(4mM) | 50μL | -20℃ 避光 干燥 |
| EthD-I（2mM） | 200μL | -20℃ 避光 干燥 |
| PBS（0.01M，PH=7.2-7.4） | 120ml×2 | 2-8℃ |
操作步骤（仅供参考）取出试剂，恢复至室温。
一、荧光显微镜检测
1. 准备 2μM Calcein AM 和 4μM EthD-I 的染色工作液：取出 Calcein AM和EthD-I 原液，使其恢复室温。将 5μL 4 mM Calcein AM 和 20μL 2 mM EthD-I 原液与10 mL PBS （0.01M，PH=7.2-7.4）混合，涡旋混匀。上述工作液可直接用于细胞染色。
注：Calcein AM 的水溶液易水解，染色工作液应当天用完。Calcein AM和EthD-I 的浓度选择依据所用细胞类型不同而有所区别，推荐浓度范围为 0.1-10μM。
2. 对于贴壁细胞，可用 1×PBS 清洗 2~3 次后进行染色。对于悬浮细胞，250-1000×g室温离5min，收集细胞染色。
3. 用 1×PBS 充分清洗细胞 2-3 次，以充分去除残留的酯酶活性。
4. 吸弃 PBS 溶液，以 96 孔板为例，对于贴壁细胞，细胞量在每孔1-5×105/mL时，加入染色工作液 200ul；对于悬浮细胞，加入适量的染色工作液，使细胞密度控制在1-5×105/mL。
5. 室温避光孵育 15-20min （如果工作液浓度较高或者孵育温度较高，应适当的减少孵育时间）。
6. 荧光显微镜下观察标记的细胞。染料-DNA 复合物的最大激发波长490±10nm，最大发射波长分别为 515nm 和 617nm。
注：在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用 PBS 清洗完染料之后再观察。
7. 结果分析：荧光显微镜下，使用 490±10nm 波长激发，活细胞为黄绿色，死活细胞为红色。用 528nm 波长激发，能够看到红色的死细胞。
二、流式细胞检测
1. 准备 2μM Calcein AM 和 4μM EthD-I 的染色工作液：取出Calcein AM和EthD-I 原液，使其恢复室温。将 5μL 4mM Calcein AM 和 20μL 2mM EthD-I 与 10mL PBS（0.01M，PH=7.2-7.4）混合，涡旋混匀。上述工作液可直接用于细胞染色。
2. 用 1×PBS 充分清洗细胞 2-3 次，以充分去除残留的酯酶活性。
3. 用 0.5mL 染色工作液悬浮细胞，控制细胞密度为 1-5×105/mL。
注：我们推荐准备两管额外的样品，每管只加入一种染料（Calcein AM和EthD-I），用于流式单染的补偿调节。
4. 室温避光孵育 15-20 min。
5. 在 30min 内，通过流式细胞仪检测细胞活性。Calcein AM 可以由488nm激光激发，检测荧光发射光谱约在 530nm 处，EthD-I 发射光谱约在 617nm 处。
注：细胞圈门时，注意排除细胞碎片，使用单染管调节补偿，双染管流式检测应获得两个相对独立的细胞群：显示绿色荧光的活细 胞群和红色荧光的死细胞群。
注：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料针对不同细胞的最佳工作浓度。
a) 用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%毛地黄皂苷处理细胞 10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
b) 用 0.1-10µM 的 EthD-I 溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
c) 用 0.1-10µM 的 Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。
注意事项1. 贴壁细胞也可以不消化，直接去除培养基，经 1×PBS 浸洗 2min，2 次。按上述细胞量和染色液浓度比例进行染色，染色时间和染色液工作浓度可按实际检测调整。
2. Calcein-AM 作用于细胞，一般细胞量在 1-5×105/mL，Calcein-AM的工作浓度基本在1-2uM；EthD-I 的工作浓度在 2.5-5uM。但由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM 和 EthD-I 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
3. 操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。
4. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
5. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
6. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
7. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。
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